逆轉錄實驗步驟：引物濃度計算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉錄酶進行RT（10ul體積）1、準備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活AMV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉錄實驗時注意事項：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。逆轉錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。成都cDNA合成反轉錄蛋白檢測

miRNA加尾法逆轉錄：miRNA，即microRNA，是一類非常短的RNA分子，只有幾十到幾百個核首酸，在正常細胞存活期間會產(chǎn)生大量的miRNA。miRNA起著重要的抑制作用，它可以抑制特定mRNA的表達以及細胞中內(nèi)含物翻譯和轉錄等功能他們是催化機制，負責影響細胞及其產(chǎn)物的生物學復雜性和穩(wěn)定性，對于宿主機體影響是非常重要的。miRNA加尾法是一種獲得miRNA及其前體的研究方法之。較重要的是，它是RNA千擾技術的一個重要組成部分。過去的研究發(fā)現(xiàn)，通過miRNA加尾法獲得的新miRNA表達調(diào)節(jié)了細胞信號傳導、細胞分裂和細胞凋亡等多重信號傳遞通路，其過程非常復雜。成都cDNA合成反轉錄蛋白檢測逆轉錄實驗過程需適當?shù)腞NA質(zhì)量，過少或質(zhì)量不佳將影響擴增效果。

miRNA的加尾法逆轉錄和qPCR，miRNA與mRNA的在qRT-PCR過程有所不同。一般來講，mRNA比較長，其長度通常在幾百至幾千個核苷酸，因此使用隨機引物(RandomPrimerp(dN)6)即可隨機結合到mRNA的各位置進行逆轉錄。由于qPCR的過程只需擴增目的片段的一部分(80~200bp)，因此使用隨機引物的逆轉錄產(chǎn)物盡管不完整，也完全能夠滿足qPCR的需求。當然，也可以使用OligodT引物統(tǒng)一從mRNA的ployA尾巴開始逆轉錄。這種逆轉錄引物在擴增cDNA全長時是必須的，但要注意，原核生物的mRNA和某些lncRNA不具有ployA尾，因此不能使用OligodT引物進行逆轉錄。

逆轉錄實驗過程中要注意RNA樣品的保存、純化、處理和轉錄酶的選擇，逆轉錄實驗前要對反應體系進行無RNA和無反轉錄酶的對照。多逆轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①RNA指導的DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5′端水解掉RNA分子。逆轉錄是2代測序、單細胞測序等技術的前置步驟。

逆轉錄酶（M-MLV）從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來，可用于合成首先鏈cDNA、制作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同，同時其延伸能力也有明顯提高。逆轉錄酶（M-MLV）一個活性單位定義為在37℃，10min條件下，使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉淀物質(zhì)所需的酶量。逆轉錄酶的三個功能：1、RNA為模板指導的DNA聚合酶活性；2、DNA為模板指導的DNA聚合酶活性；3、RNaseh活性。逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導下的DNA合成。成都cDNA合成反轉錄蛋白檢測

逆轉錄過程是病毒的復制形式之一，如RNA病毒中的逆轉錄病毒。成都cDNA合成反轉錄蛋白檢測

大多數(shù)逆轉錄酶都具有多種酶活性，主要包括以下幾種活性。①DNA聚合酶活性；以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物，多為賴氨酸的tRNA，在引物tRNA3'－末端以5'→3'方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高。②RNaseH活性；由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNaseH從RNA5'端水解掉RNA分子。③DNA指導的DNA聚合酶活性；以反轉錄合成的首先條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。成都cDNA合成反轉錄蛋白檢測

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