RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversetranscription-PCR，RT-PCR），是以RNA為材料應用于PCR擴增中的一種實驗方法。首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA或信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA）。其次TaqDNA聚合酶以cDNA為模板進行qPCR擴增。RT-PCR已被普遍應用于多種分子生物學應用中，包括基因表達分析、基因測試、RNA干擾驗證檢測、微陣列驗證、病原體檢測和疾病研究。RT-PCR的方法之一步法和兩步法：RT-PCR其操作方法分為兩種，即一步法和兩步法。一步法RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴增結(jié)合在一起，即cDNA合成與PCR擴增反應在同一管Buffer及酶中進行，一步完成。兩步法RT-PCR，RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，分成兩步進行。酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個重要表示。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑蛋白質(zhì)提取

逆轉(zhuǎn)錄是一種重要的生物學現(xiàn)象，它在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。逆轉(zhuǎn)錄是指將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的過程，與正常的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的過程相反。這個過程由逆轉(zhuǎn)錄酶來完成，而逆轉(zhuǎn)錄酶是一種酶類蛋白質(zhì)，普遍存在于病毒和一些細胞中。逆轉(zhuǎn)錄的重要性在于它是某些病毒的復制過程中必不可少的一步。許多病毒的遺傳物質(zhì)是RNA分子，而它們必須先將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA，才能利用細胞的合成機制來進行復制。這種轉(zhuǎn)錄過程一旦完成，病毒的DNA就可以與宿主細胞的DNA結(jié)合在一起，從而使病毒的遺傳物質(zhì)被復制并傳遞下去。重慶彩色逆轉(zhuǎn)錄混合純度高逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達調(diào)控等領(lǐng)域有普遍的應用前景。

RNA逆轉(zhuǎn)錄實驗注意事項：RNA定量：除了掌握RNA的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對RNA濃度進行測定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會對上樣量有要求，建議totalRNA上樣量小于5μg。超過這個范圍，會使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性(表達豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄)而造成定量結(jié)果不準確。逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇：逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含3種：oligodT引物，隨機引物和特異性引物。對于短的且不具備發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細胞mRNA，三種都可用。逆轉(zhuǎn)錄實驗過程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項，隨機引物：適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個gene表達量很低）。選擇隨機引物時，首先鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板，然后進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng，如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng，可能會導致小片段產(chǎn)物（<500bp）的增加和長片斷、全長產(chǎn)物產(chǎn)物的降低。酵母菌逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄酶家族中的一個重要表示，逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達調(diào)控等領(lǐng)域有普遍的應用前景。逆轉(zhuǎn)錄也可作為RNA表達譜的分析方法。

逆轉(zhuǎn)錄的端粒復制：對于線性基因組，其滯后鏈的末端是無法完整復制的，每次約損失30-200個核苷酸（Cells.2020Feb22;9(2).）。這樣隨著細胞分裂，端粒會持續(xù)縮短，造成復制性衰老。對于大多數(shù)體細胞來說，端粒磨損是一種控制其分裂潛力的機制，但對于需要多次增殖的干細胞來說，必須設法維持端粒長度。端粒酶（telomerase）可以通過逆轉(zhuǎn)錄過程延長端粒。端粒酶由端粒酶RNA（TERC）和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）組成。TERT使用TERC作為模板，在染色體的單鏈末端合成端粒DNA的重復序列。大多數(shù)體細胞缺乏端粒酶活性，因而容易衰老。但未分化的生殖細胞，干細胞，活化的淋巴細胞和大多數(shù)疙瘩細胞具有高水平的端粒酶活性，可以克服端粒磨損并維持無限的細胞分裂。逆轉(zhuǎn)錄實驗可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染。南京快速逆轉(zhuǎn)錄報價表

逆轉(zhuǎn)錄實驗避免RNA樣品的過凍、過熱處理，影響逆轉(zhuǎn)錄反應的效果。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑蛋白質(zhì)提取

逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)有重要的理論意義和實踐意義。（1）在致死病毒的研究中發(fā)現(xiàn)了病基因，在人類一些病細胞如膀胱病、小細胞肺病等細胞中，也分離出與病毒病基因相同的堿基序列，稱為細胞病基因或原病基因。病基因的發(fā)現(xiàn)為疙瘩發(fā)病機理的研究提供了很有前途的線索。（2）在實際工作中有助于基因工程的實施。由于目的基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物易于制備，可將mRNA反向轉(zhuǎn)錄形成DNA用以獲得目的基因。逆轉(zhuǎn)錄酶實驗操作注意事項：RNA提取一定要迅速，樣本要新鮮，組織盡量在液氮中研磨；RNA提取完馬上進行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延，新提的RNA很容易降解；逆轉(zhuǎn)錄反應過程，需建立無RNAase環(huán)境，以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的統(tǒng)稱，包含RNaseA，RNaseH等，RNaseA可以水解單雙鏈RNA，RNaseH主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA。一體化逆轉(zhuǎn)錄試劑蛋白質(zhì)提取

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