miRNA的加尾法逆轉(zhuǎn)錄和qPCR，miRNA加尾法逆轉(zhuǎn)錄：增加miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度較直接的方法就是增加miRNA的長(zhǎng)度，即在miRNA的3端后面添加一段序列，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。因此，加尾法是由兩個(gè)酶共同作用完成的，它們分別是PolyA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。PolyA聚合酶負(fù)責(zé)給miRNA加上PolyA尾，增加其長(zhǎng)度。之后逆轉(zhuǎn)錄引物結(jié)合到PolyA序列上，由逆轉(zhuǎn)錄酶完成加長(zhǎng)版cDNA的合成。miRNA的加尾法逆轉(zhuǎn)錄和qPCR中的qPCR：miRNA熒光定量PCR的過(guò)程跟普通mRNA的相似，但由于加尾法逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5端均為通用序列，因此其qPCR反向引物都是相同的(通用引物R)，不同的是根據(jù)miRNA序列設(shè)計(jì)的正向引物。正向引物的特異性就變得非常重要。對(duì)于內(nèi)參，生工生物的miRNA加尾法首先鏈cDNA合成試劑盒(B532451)中內(nèi)置了內(nèi)參U6的正向引物，使用該引物與通用引物R即可進(jìn)行內(nèi)參U6的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄在病毒學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用。重慶彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑研發(fā)

逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程：生物體中的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程就比較復(fù)雜，比如逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）。病毒是真正的“極簡(jiǎn)風(fēng)”，所有東西都?jí)嚎s到非常。比如它的基因組中，經(jīng)常有些基因是重疊、嵌套結(jié)構(gòu)，充分利用每一個(gè)堿基。所以它也不會(huì)專門(mén)編碼一個(gè)引發(fā)酶來(lái)合成引物，它一般是在組裝時(shí)帶走宿主的tRNA，在下次侵染時(shí)當(dāng)作引物使用。被用作引物的tRNA會(huì)結(jié)合在病毒基因組RNA鏈的中間，所以首先次只能合成出一部分cDNA，然后利用基因組RNA兩端的一段重復(fù)序列，“跳”回另一端，完成整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄。之后水解RNA鏈的時(shí)候，會(huì)留下一些片段作為復(fù)制的引物。雙鏈DNA的合成同樣也需要經(jīng)過(guò)一次跳躍（jump），以合成完整雙鏈。較后兩端具有相同的序列，稱為長(zhǎng)末端重復(fù)（longterminalrepeats，LTR）。LTR不只包含跳躍時(shí)用來(lái)配對(duì)的序列，還有整合信號(hào)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、polyA位點(diǎn)等重要結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)沙帶gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄混合逆轉(zhuǎn)錄在研究RNA表達(dá)調(diào)控等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用前景。

反轉(zhuǎn)錄酶的注意事項(xiàng)，在進(jìn)行RT反應(yīng)之前，應(yīng)考慮以下幾個(gè)方面：RNA：成功的cDNA合成來(lái)自高質(zhì)量的RNA，高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長(zhǎng)并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。在提取RNA的過(guò)程中，要特別防止RNase的污染，同時(shí)在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長(zhǎng)度和產(chǎn)量。RNase抑制劑要在首先鏈cDNA合成反應(yīng)中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因?yàn)閏DNA合成前的過(guò)程會(huì)使抑制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解RNA的RNase。蛋白R(shí)Nase抑制劑只防止RNaseA，B，C對(duì)RNA的降解，并不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中經(jīng)常更換新手套。

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備工作：1、實(shí)驗(yàn)器具與材料：（1）移液頭：200ul、10ul；（2）吸頭：200ul、20ul；（3）EP管1。5ml、100ul；（4）水浴箱。2、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備，塑料制品：（包括吸頭、EP管等）將塑料制品逐個(gè)浸泡于1‰DEPC水中（必要時(shí)小頭頭需要用吸管打入DEPC水）37℃過(guò)夜，然后送至高壓3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小時(shí)左右烘干），試驗(yàn)前將頭頭放入吸頭臺(tái)。3、試劑配制和準(zhǔn)備：（1）DEPC水：泡實(shí)驗(yàn)器具的DEPC水的配制：1000ml雙蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)后備用。逆轉(zhuǎn)錄中所用的DEPC水的配制：100ml鹽水瓶?jī)?nèi)裝40ml雙蒸水，加40ulDEPC，37℃過(guò)夜，送至高壓，后分裝到幾個(gè)1。5mlEP管中，-20℃中保存?zhèn)溆?。?）RT中所需要的各種試劑。逆轉(zhuǎn)錄的目的是將RNA變?yōu)镈NA，便于PCR擴(kuò)增。

反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,也可寫(xiě)成逆轉(zhuǎn)錄酶)又稱為依賴RNA的DNA聚合酶。1970年Temin等在致死RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA聚合酶，該酶以RNA為模板，以dNTP為底物，tRNA(主要是色氨酸t(yī)RNA)為引物，在tRNA3'-OH末端上，根據(jù)堿基配對(duì)的原則，按5'-3'方向合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementaryDNA，CDNA)。反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）是以RNA為模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核苷酸合成互補(bǔ)DNA（cDNA）的酶。哺乳類C型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶和鼠類B型病毒的反轉(zhuǎn)錄酶都是一條多肽鏈。鳥(niǎo)類RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄酶則由兩上亞基結(jié)構(gòu)。真核生物中也都分離出具有不同結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要使用干燥無(wú)菌的管頭和標(biāo)本采集器避免受外界污染。長(zhǎng)沙帶gDNA Remover逆轉(zhuǎn)錄混合

逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)可以進(jìn)行從RNA到DNA的轉(zhuǎn)化，從而保護(hù)RNA序列的完整性。重慶彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑研發(fā)

逆轉(zhuǎn)錄常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法之RNA濃度不高：a)、原始組織樣本或細(xì)胞量太少:提高加入量。b)、RNA發(fā)生降解:如果使用者確定提取RNA的試劑/器具沒(méi)有問(wèn)題，RNA的降解通常發(fā)生在樣品破碎/勻漿階段。有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源RNase活性:1.立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿。這只適合培養(yǎng)細(xì)胞及內(nèi)源RNase含量較低的并且較容易勻漿的組織，2.對(duì)于內(nèi)源RNase含量高或不易勻漿的組織，如肝臟、胰腺、脾臟、肌肉等，或植物組織，需要切成小塊后立即投入液氮冷凍，再按說(shuō)明進(jìn)行破碎/勻漿。c)、加入異丙醇后室溫沉淀10min或-20C冰沉淀30min即可，無(wú)需過(guò)夜沉淀。重慶彩色逆轉(zhuǎn)錄試劑試劑研發(fā)

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