酵母雙雜交還可以這么用？Y2H-seq 揭示不老松年齡。***小歐又給大家?guī)砹艘黄湍鸽p雜交結(jié)合高通量測序技術(shù)的應(yīng)用文章。北京林業(yè)大學(xué)鈕世輝老師團隊，在傳統(tǒng)的酵母雙雜交技術(shù)流程基礎(chǔ)上，巧妙的結(jié)合了NGS技術(shù)，優(yōu)化建立了Y2H-seq技術(shù)，**縮短了常規(guī)的篩庫后測序驗證周期，節(jié)約了實驗成本。文章中應(yīng)用Y2H-seq技術(shù)，對不老松年齡密碼進行了有趣的研究，其中所用酵母雙雜交文庫由歐易生物協(xié)助完成。眾所周知，酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白相互作用的利器。目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。但是做過酵母雜交實驗的小伙伴也都知道蛋白篩選較容易，但是篩選后，想知道獲得的陽性克隆都對應(yīng)的是啥基因，所花費的人力物力相當不小。有困難解決困難，勇敢牛牛不怕困難。專業(yè)酵母文庫構(gòu)建和篩選公司多年經(jīng)驗。湖北酵母文庫

酵母雙雜交篩選實驗：為進一步了解LEA3蛋白在干旱脅迫下調(diào)控植物生長和增強抗旱性的分子機制，本研究以干旱脅迫條件下的棉花根莖葉為材料，構(gòu)建了棉花干旱脅迫酵母文庫。并以GhLEA3為誘餌，采用酵母雙雜交篩選實驗，從棉花酵母文庫中篩選獲得了GhLEA3互作蛋白，并對互作蛋白進行了GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)其中的互作蛋白GhVDAC1主要參與鈣信號通路和cGMP-PKG信號通路，互作蛋白Gh***A參與多種生物途徑，如糖原生成和代謝途徑。此外，GhVDAC1和Gh***A受干旱脅迫誘導(dǎo)表達***，且在GhLEA3敲除的棉株中表達量低于野生型棉株吉林生物技術(shù)酵母文庫歐易生物一直助力于各酵母文庫實驗室更好的使用該項技術(shù)，探索生命科學(xué)奧秘。

利用酵母雙雜交技術(shù)進行篩選，結(jié)果顯示SP8可以與水稻OsMYC3蛋白相互作用，并且二者互作關(guān)系通過酵母一對一互作、BiFC、Co-IP、LCI實驗得以驗證（圖A-C）。利用截短的SP8進行酵母一對一互作和Co-IP檢測表明，與OsMYC3的結(jié)合依賴于SP8的NTP結(jié)構(gòu)域（圖D-E）；同樣，OsMYC3的TAD結(jié)構(gòu)域也是二者互作所必不可少的（圖F）。酵母雙雜交、BiFC實驗表明，OsMYC3可以與OsJAZ相互作用。經(jīng)茉莉酸處理，野生對照株根的長度明顯被抑制、一系列JA生物合成和信號傳導(dǎo)相關(guān)基因表達量上升，但Osmyc3突變體中抑制程度減輕、JA相關(guān)基因表達量上升減少。

小歐從2018年即開始關(guān)注酵母雜交與高通量測序相結(jié)合的技術(shù)發(fā)展，如2017年CaoGang老師等發(fā)表的RLL-Y2H技術(shù)，實現(xiàn)了文庫篩文庫可能，該技術(shù)通過對酵母雙雜常用載體的改造，并結(jié)合高通量測序，可直接獲得AD-BD互作蛋白對。所用方法相當巧妙，感興趣的同學(xué)請點擊《當酵母雙雜交遇到高通量測序》。鈕老師團隊之前的研究已經(jīng)鑒定了DAL1作為一種保守的針葉樹年齡生物標記基因，在油松從營養(yǎng)生長到生殖生長的時相轉(zhuǎn)變過程中起重要作用。為了進一步理解年齡效應(yīng)如何驅(qū)動針葉樹的發(fā)育，闡明與DAL1相關(guān)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)很關(guān)鍵。鈕老師團隊利用傳統(tǒng)的Y2H篩選技術(shù)結(jié)合NGS測序技術(shù)，優(yōu)化得到了Y2H-seq技術(shù)，與傳統(tǒng)的篩選測序相比，大幅度節(jié)省了時間和實驗成本。酵母文庫構(gòu)建的目的酵母的做法。

酵母雙雜交、pulldown和BiFC實驗均顯示，MdTRB1可以通過其C末端與JAZ1蛋白互作。在蘋果葉片和愈傷組織中過表達MdJAZ1，花青素和原花青素的累積受到明顯抑制。在蘋果葉片和愈傷組織***表達MdJAZ1/MdJAZ1，結(jié)果顯示過表達MdJAZ1抑制了MdTRB1對花青素和原花青素累積的促進作用。Pull down 實驗和熒光素酶互補成像實驗結(jié)果表明，在 MdJAZ1 存在下，MdTRB1 與 MdMYB9 的結(jié)合減弱（圖 a-c）；外源施加 JA 可以部分恢復(fù) MdTRB1 與 MdMYB9 的結(jié)合。對于 MdTRB1 在 JA 介導(dǎo)的花青素和原花青素積累中的作用機制，本研究建立了一個新的模型：MdTRB1 通過與 MdMYB9 互作，增強了 MdMYB9 對下游基因的轉(zhuǎn)錄***活性，進而正向調(diào)節(jié)了 JA 介導(dǎo)的花青素和原花青素累積。在 JA 缺乏的條件下，MdJAZ1 與 MdTRB1 互作，干擾了 MdTRB1 與 MdMYB9 之間的結(jié)合；在 JA 存在的條件下，MdJAZ1 被降解，MdTRB1 被釋放出來以參與后續(xù)過程。從該技術(shù)開發(fā)以來，雙雜交和三雜交報告基因數(shù)量從1個報告基因增加到了4個，降低了假陽性概率。湖北酵母文庫

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酵母單雜交結(jié)果顯示，磷酸鹽饑餓響應(yīng)因子OsPHR1/2/3可以***51個目標啟動子中的25個，包括OsRAM1、OsRAD1、OsWRI5A等。OsRAM1、OsRAD1、OsWRI5A自身又可以調(diào)控許多菌根共生相關(guān)基因的表達（圖A）。對叢枝菌根共生響應(yīng)基因啟動子序列預(yù)測分析顯示，有78個轉(zhuǎn)錄因子被富集，87%的菌根共生響應(yīng)基因受到OsPHR1/2/3的調(diào)控，其中42%受到OsPHR1/2/3的直接調(diào)控。因此推測OsPHR1/2/3可能是菌根共生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵調(diào)控樞紐（圖A-B）。EMSA和熒光素酶報告實驗證實，OsPHR12可以直接結(jié)合并***OsRAM1、OsWRI5A、OsPT11、OsAMT3啟動子序列（圖C-F），并且這種結(jié)合依賴于啟動子中的P1BS元件（圖G）。湖北酵母文庫

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