數(shù)字PCR技術(shù)的出現(xiàn)不是為了完全取代原有分子診斷技術(shù)，而是更好的補充和完善現(xiàn)有技術(shù)平臺。數(shù)字PCR為不同應用場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路，尤其是在臨床檢測方面。國產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)在商業(yè)化應用方面，也不斷“攻城略地”。數(shù)字PCR作為當下靈敏的核酸檢測技術(shù)，盡管目前國產(chǎn)數(shù)字PCR企業(yè)異軍突起，在臨床市場中實現(xiàn)了彎道超車，但未來仍然需要聚焦客戶需求，不斷夯實底層創(chuàng)新，同時在檢測成本、自動化、試劑盒申報注冊、出海國際化等方面不斷努力，提供更為的解決方案。國際局勢，波譎云詭。在百年未有之大變局，實現(xiàn)中華民族的偉大復興，需要國內(nèi)企業(yè)瞄準技術(shù)高地，以爭分奪秒的精神，解決技術(shù)"卡脖子"的難題，不斷攻堅克難，自主創(chuàng)新，在與國際品牌的同臺競技中，彰顯中國實力。在使用dPCR進行轉(zhuǎn)基因檢測時，通常直接參照qPCR的方法。微滴式數(shù)字PCR油滴制造
基于微滴的QX100dPCR儀，利用油包水技術(shù)，將樣品平均分配到20000個微滴油包水中，利用微滴分析儀對微滴進行分析。2012年RainDance公司推出了RainDropdPCR儀，在高壓氣體驅(qū)動下，將每個標準反應體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應乳液。數(shù)字PCR就形成了2大派別，芯片式和微滴式。不論是哪種數(shù)字PCR，其原理都是有限稀釋，終點PCR和泊松分布。將含有核酸模板的標準PCR反應體系，平均分配成幾萬個PCR反應，分配到芯片或微滴中，使每個反應中盡可能含有一個模板分子，進行單分子模板PCR反應，通過讀取熒光信號的有或無進行計數(shù)，經(jīng)過統(tǒng)計學泊松分布的校準進行定量。德國數(shù)字PCR性能特點數(shù)字PCR的應用甚廣，除了可應用于進行突變的檢測以外，也可運用于基因擴增的檢測。
dPCR的測量結(jié)果通常表示為含量，即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分數(shù)。目前市場上可購買到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)，以qPCR定值的標準物質(zhì)是以拷貝數(shù)（單倍體基因組當量）的質(zhì)量分數(shù)來表示特性量；以dPCR定值的標準物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會造成測量結(jié)果不可比。因此質(zhì)量分數(shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關(guān)系需要轉(zhuǎn)化，才能得到單位一致，數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分數(shù)。
數(shù)字PCR平臺的評價指標有：分割單元數(shù)，熒光通道數(shù)，操作復雜性和污染風險。但是重要的是檢測準確性，評估數(shù)字PCR平臺的一種方法是使用多個數(shù)字PCR平臺互相驗證，另一種方法是使用定值準確的標準物質(zhì)。目前的三代的PCR技術(shù)各有各的優(yōu)缺點，也各有各的應用領(lǐng)域，并不是一代取代一代的關(guān)系。技術(shù)的不斷進步給PCR技術(shù)注入了新的活力，使其能解鎖一個又一個的應用方向，使核酸檢測更方便、更準確。目前dPCR儀器的價格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價格將會不斷的降低，使其應用到更多的檢測中。3D數(shù)字PCR是基于納米流體芯片進行檢測，通過一次檢測，將樣品分到數(shù)千個單獨的PCR。
作為時下的熱點技術(shù)，數(shù)字PCR是將核酸樣品分配到大量單獨、平行的微反應單元（nL，納升級別）中，使得每個反應單元中盡可能含有1個模板分子，并在此基礎(chǔ)上進行擴增、檢測和分布統(tǒng)計，從而實現(xiàn)靶標分子的比較 計數(shù)。（圖：數(shù)字PCR技術(shù)原理）根據(jù)微反應單元的不同形式，數(shù)字PCR產(chǎn)品可分為微板式、微滴式和芯片式等。目前，市場上主要的數(shù)字PCR產(chǎn)品主要是基于微滴式和芯片式，如Bio-Rad公司的QX200微滴式系統(tǒng)和ThermoFisher公司的QuantStudio系統(tǒng)等。與一、二代PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR具有很多優(yōu)勢：一是特異性、靈敏性均有顯著提高；二是在不依賴內(nèi)參和標準曲線的前提下，可直接得到比較 量化指標；三是微反應單元相互獨立、封閉，避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產(chǎn)物間的相互干擾，準確度和可重復性較高。dPCR儀器在操作中集成了前處理以減少手工移液和樣品轉(zhuǎn)移的操作，增加了通量，并在價格上具有優(yōu)勢。蘇州數(shù)字PCR儀器
數(shù)字PCR作為研發(fā)階段的驗證方案之一。微滴式數(shù)字PCR油滴制造
數(shù)字PCR的引物和探針設(shè)計規(guī)則同熒光定量PCR是類似的，具體規(guī)則如下：1、查找和選擇目標序列設(shè)計引物和探針的第一步是得到感興趣基因的核酸序列。找到基因保守區(qū)域：基因的保守區(qū)域是指來自同一屬/種/亞型的、在某個基因上堿基序列差別很小或沒有差別的區(qū)域。根據(jù)需要，使用ClustalX或ClustalW等軟件對齊屬于同一屬/種/亞型的基因的一組序列，在對齊序列的保守區(qū)域設(shè)計引物，并確保引物結(jié)合位點處的保守序列與其它非待檢測的屬/種/亞型的堿基序列具有較大的差異。擴增產(chǎn)物長度（AmpliconLength）：可在75-200bp之間（產(chǎn)物長度=下游引物位置-上游引物位置+1）。微滴式數(shù)字PCR油滴制造
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