產(chǎn)物越短，往往擴(kuò)增效率越高。模板二級結(jié)構(gòu)（Templatesecondarystructure）：PCR變性中和變性后的單鏈DNA不夠穩(wěn)定，容易自發(fā)折疊形成二級結(jié)構(gòu)。應(yīng)避免可形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的模板鏈區(qū)域，因?yàn)槿绻０彐溞纬傻亩壗Y(jié)構(gòu)在退火溫度下穩(wěn)定存在，定位在模板鏈二級結(jié)構(gòu)處的引物將無法同模板鏈相結(jié)合。使用mfold可預(yù)測引物待結(jié)合的區(qū)域是否存在復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，盡量使引物定位在模板二級結(jié)構(gòu)以外的序列上。避免具有4個(gè)以上相同的連續(xù)堿基的區(qū)域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸階段聚合酶“滑動（PolymeraseSlippage）”。選擇GC含量（GCContent）在50-60%之間的區(qū)域。如果高GC含量區(qū)域不可避免，可以嘗試提高退火溫度，并使用添加劑，例如甘油，模板 DNA 量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。法國臻準(zhǔn)數(shù)字PCR解決方案

dPCR的測量結(jié)果通常表示為含量，即拷貝數(shù)值或轉(zhuǎn)基因質(zhì)量百分比，而QPCR結(jié)果通常表示為拷貝數(shù)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。目前市場上可購買到大多數(shù)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以qPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是以拷貝數(shù)（單倍體基因組當(dāng)量）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來表示特性量；以dPCR定值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接采用拷貝數(shù)比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式，會造成測量結(jié)果不可比。因此質(zhì)量分?jǐn)?shù)、拷貝數(shù)和拷貝數(shù)比例之間的關(guān)系需要轉(zhuǎn)化，才能得到單位一致，數(shù)值可比的數(shù)據(jù)。EU聯(lián)合研究中心建議使用轉(zhuǎn)換因子從拷貝數(shù)換算到質(zhì)量分?jǐn)?shù)。法國一體化數(shù)字PCR技術(shù)數(shù)字PCR在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時(shí)具有明顯的優(yōu)勢。

相比于cPCR技術(shù)和第二代qPCR技術(shù)，dPCR技術(shù)具有定量，可溯源至SI國際單位制摩爾；基質(zhì)成分干擾較小[51]；靈敏度高；對抑制劑的敏感性較低；適合多重轉(zhuǎn)基因檢測[52.53]，可提高分析效率；實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化簡單[54]對實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的要求較低，適合多重基因檢測等優(yōu)勢，可為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物提供準(zhǔn)確的量值保證，目前dPCR儀器的價(jià)格仍然十分昂貴，但隨著系統(tǒng)加工工藝的改進(jìn)以及使用較便宜的材料，聚合成更小的體積[556]，其價(jià)格將會不斷的降低，使其應(yīng)用到更多的檢測中。

對于檢測需要高靈敏度以及技術(shù)確認(rèn)的情況下，數(shù)字PCR技術(shù)也可以發(fā)揮重要作用。技術(shù)數(shù)據(jù)表明，數(shù)字PCR技術(shù)對的比較低檢測下限可到2copies/ml，比qPCR靈敏度提升了100倍。經(jīng)測試，數(shù)字PCR在檢測和診斷的某些方面優(yōu)于金標(biāo)準(zhǔn)qPCR，尤其是在低病毒載量樣本中，相比起qPCR，數(shù)字PCR特異性、靈敏度、重現(xiàn)性和檢測限受影響更小。因此，未來預(yù)計(jì)數(shù)字PCR技術(shù)也將在類疾病中得到更加廣的應(yīng)用。數(shù)字PCR的應(yīng)用甚廣，除了可應(yīng)用于進(jìn)行突變的檢測以外，也可運(yùn)用于基因擴(kuò)增的檢測。通過數(shù)字PCR技術(shù)可建立多重?zé)晒怏w系，用于同時(shí)檢測比如非小細(xì)胞肺中常見的MET和HER2耐藥擴(kuò)增。有研究報(bào)道，使用數(shù)字PCR技術(shù)對436例非小細(xì)胞肺樣品進(jìn)行檢測，并挑選樣本驗(yàn)證了數(shù)字PCR與RNA fish的檢測一致性。結(jié)果表明，該數(shù)字PCR技術(shù)在保證了基因擴(kuò)增檢測準(zhǔn)確性的同時(shí)，還節(jié)約了檢測時(shí)間。三重ddPCR檢測體系存在的問題：不同位點(diǎn)檢測體系之間的cross-reactivity。

了解泊松分布，我們先要從二項(xiàng)式分布說起，二項(xiàng)式分布是一個(gè)離散概率分布，它給出了m次試驗(yàn)中k次成功的可能性，每次試驗(yàn)的概率為p，例如當(dāng)擲骰子時(shí)，二項(xiàng)分布給出了在10次試驗(yàn)中恰好有7次擲出4的概率。在數(shù)字PCR的情況中，投擲骰子類似于將一個(gè)目標(biāo)實(shí)體隨機(jī)“投擲”到一組分區(qū)中，當(dāng)目標(biāo)落在選定的分區(qū)中時(shí)，就是成功。如果有n個(gè)分區(qū)，并且分區(qū)過程是完全隨機(jī)的，則目標(biāo)出現(xiàn)在所選分區(qū)中的概率為1/n。該試驗(yàn)重復(fù)m次，樣品中的每個(gè)分子一次。如下所示的二項(xiàng)式分布給出了k個(gè)成功的概率，即所選分區(qū)恰好包含k個(gè)分子的概率。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū)。當(dāng)n很大，并且嘗試成功的概率(1/n)很小時(shí)，二項(xiàng)分布可以近似為泊松分布。dPCR可直接溯源SI國際單位制摩爾，適合單一、雙重及多重轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究，一次可識別不同的轉(zhuǎn)基因區(qū)域。蘇州臻準(zhǔn)數(shù)字PCR分析應(yīng)用

通過創(chuàng)新技術(shù)微流控芯片，讓數(shù)字PCR單反應(yīng)耗材價(jià)格進(jìn)入個(gè)位數(shù)，實(shí)現(xiàn)了新的進(jìn)步，也降低開發(fā)難度。法國臻準(zhǔn)數(shù)字PCR解決方案

目前dPCR主要有兩種形式，芯片式和液滴式，但基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度?？梢允褂脦追N不同的方法來分配樣品，包括微孔板，毛細(xì)管，油乳劑和帶有核酸結(jié)合表面的小型化腔室陣列。樣品的分配使人們可以通過假設(shè)分子種群遵循泊松分布來估計(jì)不同分子的數(shù)量，根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式A=-ln[(N-X)/N]*N計(jì)算，從而解決了多個(gè)目標(biāo)分子存在于單個(gè)液滴中的可能性。法國臻準(zhǔn)數(shù)字PCR解決方案

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