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蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué):蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)是指對(duì)翻譯后的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)加工的過(guò)程。它通過(guò)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加上修飾基團(tuán),可以改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì),進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和活性狀態(tài)、亞細(xì)胞定位、折疊及其穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)翻譯后修飾的豐度變化在生命活動(dòng)研究中具有重大意義,異常的翻譯后修飾會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。質(zhì)譜可以分辨蛋白質(zhì)修飾前和修飾后分子量上的變化,因此只要知道靶蛋白翻譯后修飾前后分子量的變化,就能對(duì)翻譯后修飾方式進(jìn)行鑒定和定量。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有可靠性。貴陽(yáng)氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究
蛋白磷酸化檢測(cè)方法:一、Western Blot檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì):1. WB方法簡(jiǎn)便,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室具備Western Blot設(shè)備條件。2. 許多磷酸化抗體十分靈敏,能夠檢測(cè)低至10ug的蛋白樣品。3. 對(duì)于豐度低的蛋白,可以先通過(guò)IP使用目標(biāo)蛋白的抗體對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集,再進(jìn)行WB檢測(cè)被磷酸化的蛋白,檢測(cè)效率可以提高幾倍甚至幾十倍。二、質(zhì)譜檢測(cè)方法:Western Blot的方法雖然簡(jiǎn)便,但是對(duì)于大規(guī)模分析復(fù)雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問(wèn)題。依靠高準(zhǔn)確度質(zhì)譜儀,如今快速準(zhǔn)確分析細(xì)胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡(jiǎn)單的事。具體的檢測(cè)方法為先通過(guò)SDS-PAGE膠,或者2D-PAGE膠等分離目標(biāo)蛋白,將含有目標(biāo)蛋白的條帶切下,胰酶消化,LC-MS/MS檢測(cè)分析蛋白序列和相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化修飾。這個(gè)方法適用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。哈爾濱糖基化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)價(jià)錢(qián)質(zhì)譜可以用于已知和未知的翻譯后修飾檢測(cè)。
蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)分析:基于LC-MS/MS分析能夠精確測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽分子質(zhì)量這一特性,從而檢測(cè)蛋白質(zhì)或者多肽上位點(diǎn)發(fā)生何種修飾??蓹z測(cè)修飾類(lèi)型如下: 磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、丙?;?、丁?;?、丙二酰化、戊二?;㈢牾;渭谆?、二甲基化、三甲基化。1、磷酸化:信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理等;2、糖基化:蛋白質(zhì)折疊、更新以及免疫應(yīng)答等;3、乙?;夯虮磉_(dá)調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及神經(jīng)退行性的病變等;4、泛素化:細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等;5、甲基化:染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等;6、丙?;?/ 丙二?;?/ 戊二?;?/ 琥珀酰化:主要存在于線(xiàn)粒體和細(xì)菌中,與代謝過(guò)程密切相關(guān)。
蛋白質(zhì)翻譯后修飾在蛋白質(zhì)中磷酸化位點(diǎn)分析時(shí)應(yīng)該注意些什么問(wèn)題?覆蓋率:覆蓋率越高,檢測(cè)和鑒定含有修飾基團(tuán)的肽幾率就越大。修飾位點(diǎn)的占有率:被修飾的蛋白質(zhì)的百分比低,則檢測(cè)到修飾肽的機(jī)會(huì)會(huì)隨之減少。如果百分比較高(> 30%),則有助于識(shí)別修飾位點(diǎn)。棕櫚酰化蛋白修飾質(zhì)譜鑒定方法:S-棕櫚?;闹饕δ苁谴龠M(jìn)蛋白質(zhì)與細(xì)胞膜的結(jié)合。蛋白質(zhì)可以由一個(gè)棕櫚?;M成,也可以與更多棕櫚基或與其他脂質(zhì),如豆蔻酰基。由于對(duì)S-棕櫚酰化蛋白分析仍然具有挑戰(zhàn)性,由于S-棕櫚?;揎椀鞍讈喫揭约笆杷院蜐撛诓环€(wěn)定的硫代質(zhì)鏈的S-脂酰化肽?,F(xiàn)在常用的幾種方法可以捕獲S-脂?;鞍滓约皩?duì)目標(biāo)修飾蛋白進(jìn)行捕獲。蛋白質(zhì)磷酸化修飾的免疫印跡技術(shù)優(yōu)點(diǎn):檢測(cè)特異性高。
蛋白質(zhì)磷酸化修飾鑒定方法: Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳:Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳通過(guò)連接在丙烯酰胺分子上的雙核金屬(如Mn2+)配合物對(duì)磷酸基團(tuán)的親和,造成磷酸化蛋白遷移的滯留,再將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用相應(yīng)蛋白的抗體識(shí)別,根據(jù)遷移滯留檢測(cè)蛋白磷酸化。技術(shù)優(yōu)勢(shì)特點(diǎn):1、無(wú)放射危害。2、鑒定不受限于特異性識(shí)別蛋白質(zhì)磷酸化的抗體。3、適用于大規(guī)模磷酸化蛋白分析。4、與質(zhì)譜鑒定兼容,進(jìn)行更為精細(xì)的分析鑒定。蛋白質(zhì)乙酰化修飾,顧名思義指的就是在蛋白質(zhì)原有基礎(chǔ)上面嫁接上乙?;鶊F(tuán)。四川琥珀?;揎椀鞍踪|(zhì)組學(xué)技術(shù)服務(wù)
乙?;揎検窃撕驼婧松锼灿械囊环N翻譯后修飾類(lèi)型。貴陽(yáng)氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究
蛋白質(zhì)翻譯后修飾的檢測(cè)方法:質(zhì)譜是蛋白質(zhì)翻譯后修飾檢測(cè)的常用技術(shù)之一,可以用于已知和未知的翻譯后修飾檢測(cè)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modifications,PTMs),如磷酸化、乙?;?、泛素化、SUMO化、糖基化等,大幅度的增加了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性。檢測(cè)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾,了解它們?nèi)绾喂ぷ?、影響蛋白質(zhì)組和調(diào)控基因組將極大地提高我們對(duì)遺傳學(xué)和表觀(guān)遺傳學(xué)的理解。目標(biāo)蛋白的PTMs研究通常需要一個(gè)富集步驟,因?yàn)樾揎椀鞍椎呢S度一般較低。大多數(shù)PTMs檢測(cè)方法都是結(jié)合富集策略開(kāi)發(fā)的,以比較好的識(shí)別、驗(yàn)證和研究目標(biāo)蛋白中PTMs的功能。貴陽(yáng)氧化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究
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